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    項目文章|赫捷院士團隊揭密肺腺癌 m6A 機制再次登上Nature 子刊!
    日期:2021年09月24日    來源:

    繼前面介紹中國醫學科學院腫瘤醫院赫捷院士團隊2021年6月21日在Nature Communications(IF=14.919)上發表“METTL3 promotes tumour developmentby decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding”的食管鱗癌 m6A機制文章后,本期我們繼續為大家介紹赫捷院士團隊 2021 年 5 月 8 日在 Nature 旗下期刊 Cell Death & Disease(IF=8.47)上發表的題為 “WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis” 的肺腺癌 m6A機制文章。該研究揭示了一種 Wnt/β-catenin 介導的 FTO 下調的關鍵機制,并凸顯了 MYC mRNA 的 m6A 修飾在調節腫瘤細胞糖酵解和生長中的作用。云序生物有幸參與了兩次研究當中的m6A MeRIP-seq和RNA-seq的測序服務以及生信分析。

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    發表期刊:Cell Death & Disease
    發表日期:2021年5月8日
    影響因子:8.47
    研究方法:m6A MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP、Co-IP 實驗
    文章鏈接:WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis
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    研究內容

    一、FTO表達下調可促進肺腺癌(Lung Adenocarcinoma)的生長和轉移,FTO 下調越嚴重,病患的生存率越低
    作者首先從 TCGA 的公開數據中發現,肺腺癌組織中的 FTO 表達水平低于鄰近的正常組織,然后對 FTO 的 mRNA 進行 qPCR 實驗,驗證了這種表達差異的存在。免疫組化染色實驗也證實 FTO 的的表達水平在肺腺癌組織中要低于鄰近的正常組織。Kaplan-Meier 分析顯示,低 FTO 表達水平的病患擁有較低的總生存率。
    在人類肺腺癌細胞系中對 FTO 的 mRNA 的敲降實驗發現,FTO 表達的降低可顯著增強細胞的增殖以及非錨定依賴性生長(Anchorage-independed growth)的能力,細胞周期的速度也更快,細胞遷移和侵入性也更強。在體內實驗方面,若將 FTO 敲降的細胞系注入無胸腺裸鼠的尾靜脈內,相比于注入未敲降細胞的對照組,FTO 敲降的實驗組中的腫瘤細胞有明顯地向肺部轉移。
    上述發現都指向一個結論:FTO 在肺腺癌細胞中的下調促進了腫瘤的生長和轉移。
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    二、Wnt 信號通路提高了 FTO 啟動子區的組蛋白 H3K27me3 甲基化,從而抑制 FTO 的表達
    肺腺癌細胞中的 FTO 的表達是因為什么原因而下調的呢?為了回答這個問題,作者用 PROMO 軟件分析 FTO 基因的啟動子序列,在其中找到了 3 個有可能是 TBE 元件(LEF/TCF-binding element)的區域。為了驗證生信預測的真實性,作者又進行了了一系列分子生物學實驗。首先,ChIP 實驗證實了 TCF4 與 FTO 啟動子的結合。另外,熒光素酶報告基因的結果顯示,β-catenin 也可通過結合前述的 3 個 TBE 元件來抑制 FTO 啟動子。因此,β-catenin/LEF/TCF 復合體被證明可以抑制 FTO 啟動子的活性。人類肺腺癌細胞系經過 Wnt 處理后,FTO 的 mRNA 和蛋白表達水平均有所降低,并且這種現象可通過敲降 β-catenin 來逆轉。綜合前面的幾個發現可以證明:Wnt 在信號通路的上游,通過誘導 β-catenin,使得β-catenin/LEF/TCF 復合體結合到 FTO 啟動子上,最終抑制了 FTO 的表達。
    那么,Wnt 信號通路到底是怎么抑制 FTO 啟動子的呢?作者通過ChIP 實驗發現,FTO 基因啟動子區域的 TBE 元件區域附近的組蛋白存在 H3K27me3 的甲基化修飾現象。學界在先前的研究中已經知曉,EZH2 是一種負責組蛋白 H3K27me3 甲基化修飾的酶。通過Co-IP 實驗發現,Wnt 刺激可以促進 EZH2 與 β-catenin 的結合;通過 ChIP 實驗發現,Wnt 刺激也可以促進 EZH2 與 TBE 元件的結合。并且,敲降 EZH2 可阻斷 Wnt 對 FTO 表達的抑制作用。綜合前面的幾個發現可以證明:Wnt 信號誘導了 EZH2 與 β-catenin 的結合,導致了 FTO 啟動子附近的組蛋白發生 H3K27me3 甲基化修飾,從而抑制 FTO 表達。
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    三、FTO 表達下調可提高 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平,從而促進 c-Myc 的表達
    在肺腺癌細胞當中,哪些 RNA 會受 FTO 表達下調的調控,進而引發肺腺癌呢?為了探明 FTO 下游的分子致病原因,作者進行了 m6A 甲基化測序,發現 FTO 敲降的肺腺癌細胞當中有大量基因的 mRNA m6A 甲基化上調。FTO 是一種典型的 RNA m6A 甲基化的去修飾酶(也就是 m6A 的 “Eraser”),可以消去 m6A 甲基化,還原出普通的 A 堿基。通過云序生物m6A MeRIP-seq發現,FTO敲降細胞中有 556 個基因的 mRNA的 m6A 修飾水平升高;生信分析也發現,FTO 敲降細胞的代謝通路當中有許多基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高,其中就包括一個重要的轉錄因子 MYC。m6A MeRIP-seq的結果可以驗證,當敲降了 FTO 之后,MYC 基因的 mRNA 的終止密碼子附近的 m6A 修飾水平升高。通過云序生物m6A MeRIP-qPCR 實驗 結果也證實,FTO 的敲降可以提升 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。針對 FTO 蛋白的 RIP 實驗更是直接證明,FTO 結合在 MYC 的 mRNA 上面。綜合前面的幾個發現可以證明,FTO 可結合 MYC 的 mRNA,從而降低 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。
    那么,c-Myc 蛋白的表達水平又是如何受到調控的呢?作者設計了熒光素酶報告基因,將熒光素酶報告基因插入 MYC 的 mRNA 中,并將實驗組的 mRNA 3’ 端的 m6A 突變為其它堿基,對照組的 MYC mRNA 則不做任何堿基修飾。結果發現,FTO 敲降后,對照組的 MYC mRNA 表達了大量熒光素酶,但經過堿基突變而不再具有 m6A 的實驗組則沒有熒光素酶信號,說明 MYC 的 mRNA 3’ 端的 m6A 對于蛋白的成功翻譯不可或缺。相反地,如果過表達 FTO,那么肺腺癌細胞系的 c-Myc 蛋白的表達量會下降。但是,無論是 FTO 敲降還是過表達,MYC 的 mRNA 水平都沒有改變。綜上可知,c-Myc 蛋白表達量的變化,與 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平正相關,而與 MYC mRNA 的表達水平無關。
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    四、YTHDF1 通過結合 m6A 修飾的 MYC mRNA 來促進其翻譯
    既然 FTO 敲降所導致的 c-Myc 蛋白的表達水平上升并不是由 MYC mRNA 表達水平的變化造成的,那么造成這一現象的原因會是什么呢?會不會是 mRNA 翻譯調控呢?YTHDF1 是一種典型的 RNA m6A 甲基化識別蛋白(也就是 m6A 的 “Reader”)。用 anti-YTHDF1 抗體進行RIP實驗,發現 FTO 的敲降將會增強 YTHDF1 與 MYC mRNA 的結合。雖然敲降 YTHDF1 并沒有影響 MYC mRNA 的表達水平,但卻能降低 c-Myc 蛋白的表達水平。在上一段中發現的 FTO 的敲降所導致的 c-Myc 蛋白表達水平的上升,還會被 YTHDF1 的敲降所逆轉,說明 YTHDF1 發揮功能的位置在 FTO 的下游和 c-Myc 的上游 。綜上可知,FTO 表達下調所導致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾,可被 YTHDF1 識別并結合,從而促進 MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
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    五、FTO 表達下調所誘導的 c-Myc 表達,可促進肺腺癌細胞的糖酵解、生長、遷移、侵入和腫瘤發生
    c-Myc 蛋白在癌癥的代謝當中扮演重要的角色,因此作者就 c-Myc 的高表達在肺腺癌當中所發揮的作用進行了進一步的研究。首先,在小鼠肺腺癌細胞系中,FTO 敲降的細胞表現出己糖激酶-2(HK2) mRNA 和蛋白高表達的現象,說明 FTO 敲降細胞的糖酵解活躍。并且,FTO 敲降誘導的 HK-2 高表達現象,可被 c-Myc 敲降所逆轉,說明 c-Myc 發揮功能的位置在 FTO 的下游和己糖激酶的上游。類似地,FTO 敲降細胞的葡萄糖攝取、乳糖生成、細胞增殖、細胞遷移、細胞侵入能力等均有升高,且這些升高現象均可被 c-Myc 敲降所逆轉。
    作者進一步進行了體內實驗:在無胸腺裸鼠體內,注入 FTO 敲降的肺腺癌細胞系可以促進腫瘤生長,且該生長促進的現象可被 c-Myc 的敲降所逆轉。免疫組化染色實驗發現,在注入了 FTO 敲降細胞的腫瘤組織當中,c-Myc、HK-2 以及 Ki67(一種細胞增殖的標志物)均有高表達,且該現象可被 c-Myc 敲降所逆轉。此外,注入了 FTO 敲降細胞的裸鼠發生了腫瘤轉移,且這種轉移可被 c-Myc 敲降所抑制。綜合前面的幾個發現可以證明:FTO 表達下調所誘導的 c-Myc 表達,可在小鼠體內促進肺腺癌的生長和轉移。
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    要點總結


    在本研究當中,作者發現:
    • 肺腺癌組織當中,m6A 的去修飾化酶 FTO 的表達水平存在下調。
    • Wnt 信號誘導的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復合體結合于 FTO 基因啟動子區域的 TBE 元件區域,通過組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉錄。
    • 通過m6A MeRIP-seq發現FTO 的表達下調使得包含 MYC 在內的多種代謝相關基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高。
    • MYC mRNA 的 m6A 修飾可以募集 m6A 識別蛋白 YTHDF1 的結合,從而促進 c-Myc 蛋白的翻譯表達,進而提升腫瘤細胞的糖酵解水平和細胞增殖能力,促進腫瘤發生。
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    云序點評


    本篇論文體現了從酶出發研究 RNA 的 m6A 修飾的一種經典研究思路。
    首先,作者發現了肺腺癌當中 m6A 去修飾化酶 FTO 的異常低表達,就此選定 FTO 這個酶為研究對象。緊接著,作者敲降 FTO 以控制變量,以研究 FTO 這個酶在肺腺癌中所發揮的功能。下一步,作者從上游和下游兩個方向篩選出與 FTO 基因或 FTO蛋白發生互作的分子:一方面,通過一系列Co-IP、ChIP 熒光素酶報告實驗,作者證明 FTO 基因是 Wnt 信號通路的靶基因,Wnt 誘導的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復合體結合于 FTO 基因啟動子區域的 TBE 元件區域,通過組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉錄;另一方面,通過m6A MeRIP-seq 和生信預測,作者篩選出 MYC 作為 FTO 蛋白的靶基因,并通過一系列的MeRIP-qPCR、RIP 熒光素酶報告實驗,證明 c-Myc 蛋白的表達量是跟隨 FTO 蛋白表達量變化的因變量。
    在研究了 FTO 對肺腺癌的作用機制的基礎上,作者還進一步探索了 m6A 識別蛋白 YTHDF1 在肺腺癌中扮演的角色。首先,通過 RIP實驗,作者證明了 YTHDF1 與 MYC mRNA 的結合。隨后,通過結合 FTO 敲降和 YTHDF1 敲降實驗的結果,證明 FTO 表達下調所導致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾,可被 YTHDF1 識別并結合,從而促進 MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
    在本研究當中,肺腺癌致病機理當中的 “Eraser” 和 “Reader” 都得到了闡釋。這些新發現對于肺腺癌的治療提供了一種全新的潛在思路。


    云序生物 m6A 修飾研究五大模塊

    01 m6A RNA修飾測序
    m6A RNA修飾測序(m6A-meRIP-seq
    對m6A RNA甲基化,目前最流行的檢測手段為m6A-Seq技術,適用于m6A RNA甲基化譜研究,快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序:
    • 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
    • LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
    • Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
    • mRNA測序
    • miRNA測序
    02 檢測整體m6A RNA修飾水平
    LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
    精準高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
    比色法檢測整體RNA修飾水平
    快速檢測m6A整體甲基化水平
    03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
    m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
    尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
    04 m6A RNA修飾靶基因驗證
     meRIP-qPCR
    云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
    05機制互作研究
    RIP-seq/qPCR
    篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
    RNA pull down -MS/WB
    篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
    雙熒光素酶實驗
    驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
    ChIP-seq
    篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。


    云序生物服務優勢

    優勢一:發表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表53+篇高水平文章,合計影響因子460分+,是國內支持發文最多、累計影響因子最高的公司。
    優勢二:至今完成4000+例 m6A測序樣本,全面覆蓋醫口、農口等各類樣本。
    優勢三:全面檢測mRNA和各類非編碼RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
    優勢四:獨家提供m6A一站式服務:m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIPRNA pull-down等。
    優勢五:率先研發超微量MeRIP測序技術,RNA量低至500ng起。
    優勢六:國內最全的RNA修飾測序平臺,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙?;?'-O-甲基化測序。

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