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    云序新品|EM-seq 測序助力 ctDNA 甲基化研究更上層樓
    日期:2021年10月15日    來源:
    ctDNA甲基化:你的下一個高分文章利器

    循環腫瘤 DNA(Circulating Tumor DNA,簡稱“ctDNA”) 是游離 DNA(Cell-free DNA,cfDNA)當中的一個類別。ctDNA 是一種很有潛力的腫瘤分子標志物。近十年來,ctDNA 和 cfDNA 相關的論文發表呈井噴之勢,至2020 年,PubMed 收錄的 ctDNA/cfDNA 全年論文發表量已多達 2425 篇之多,成為一大新的科研熱點。
    cfDNA/ctDNA論文數量

    在這個新興的研究領域當中,已經有很多重磅級論文發表。在這其中,又有可觀的一部分用到了 ctDNA 甲基化測序的實驗方法:
    【IF=43.842】中山大學徐瑞華教授團隊 2017 年在 Nature Materials 上發表的文章,建立了一個基于 ctDNA 甲基化數據建立的高靈敏度、高特異度的肝癌診斷和預后預測模型。
    【IF=44.544】約翰霍普金斯大學 Kala Visvanathan 等人  2017 年在 Journal of Clinical Oncology 上發表的文章發現,乳腺癌病患的無惡化生存期以及總體生存率均與血清 DNA 中 10 個特定基因的甲基化水平顯著相關,可作為用于預測乳腺癌病患生存率的指標。
    【IF=33.976】巴黎索邦-西岱大學J. B. Bachet 等人 2018 年發表在 Annals of Oncology 的文章發現,利用ctDNA 的基因突變以及甲基化進行數據分析,可在近似于目前所以臨床檢測手段靈敏度的前提下,大大縮減結直腸癌肝轉移患者患者的 RAS 基因突變的檢測所需的時長。
    【IF=49.962】多倫多大學Shu Yi Shen , Scott Bratman 和 Daniel De Carvalho等人 2018 年發表在 Nature 上的文章中介紹了一種基于免疫沉淀的高靈敏度檢測方法,以少量 cfDNA的甲基組數據來挖掘不同類型腫瘤特定的甲基化模式,這項工作為建立基于 cfDNA甲基化模式的早期癌癥的微創檢測、攔截和分類的生物標志物奠定了基礎。
    【IF=14.808】 倫敦大學學院的 Anjui Wu 等人 2020 年發表在 Journal of Clinical Investigation 上的文章顯示,轉移性耐閹割前列腺癌(mCRPC)病患血漿 DNA 甲基化主成分分析可以準確量化 cfDNA 的組成成分,并有效鑒別不同的 mCRPC 表型。
    【IF=25.671】北京協和醫院梁乃新教授等人 2021 年在 Nature Biomedical Engineering上發表的文章發現,在機器學習的甲基化模式分類器的幫助下,深度甲基化測序能夠在稀釋系數低至萬分之一的情況下利用 ctDNA 樣本檢測出肺癌的腫瘤信號。

    以上的這些關于 ctDNA 甲基化研究的高分論文說明,各類腫瘤患者的ctDNA的甲基化特征擁有廣泛的研究價值。由于 ctDNA 的甲基化在腫瘤患者當中的存在量以及存在位點往往會相比健康個體發生巨大變化,因此可以作為各類腫瘤的分子標志物,或用于ctDNA 的組織細胞類型溯源。

    ctDNA甲基化液體活檢:破圈的新熱點
    ctDNA/cfDNA 之所以引起學界這么大的研究熱情,與其在臨床上廣闊的應用前景是分不開的。相比于目前腫瘤診斷當中廣泛使用的組織活檢,ctDNA 測序對患者的傷害小,且可以多次、實時地進行提取檢測,在臨床運用上具有極大的優勢,有助于癌癥的早發現、早治療,被譽為“液體切片活檢”。ctDNA 的甲基化檢測,同時結合了 ctDNA 測序于 DNA 甲基化測序的優勢,在癌癥檢測方面提供更好的特異性和靈敏度。在 2021 年的今天,已有 ctDNA/cfDNA 甲基化測序相關的商業化產品面市:

    總部位于多倫多的Adela公司提供血液全基因組甲基化富集技術服務,就可通過免疫沉淀(cfMeDIP-seq)的溫和方法避免了寶貴的基因組材料和信息的損失,將 cfDNA 樣品需求量降低至了納克級別,并將測序數據用于機器學習,最終達到疾病的檢測、分類以及起源組織溯源的目的。Adela 公司在 2021 年 6 月獲得了 F-Prime Capital 領投的 6000 萬美元的 A 輪融資,收到科學界和投資界的共同矚目。Adela 公司由前文介紹過的高分論文共同作者之一 Scott Bratman 擔任 CEO,通訊作者由Daniel De Carvalho 教授擔任公司的首席科學家,是一個“從實驗室到病床邊”( bench to bedside)的成功轉化案例。

    另一邊廂,由納斯達克上市公司Twist Bioscience 開發的 NGS Methylation Detection System也于 2021年10月面世。該方法利用基于酶學技術的溫和手段達成 ctDNA 甲基化測序的目的,相比傳統方法多獲得 15% 以上的信息。該產品涵蓋了 TCGA 數據庫中的47種疾病實體和31種癌癥類型,如肺癌、乳腺癌和結直腸癌,每種癌癥都有大約1000個信息基因組區域,并可根據客戶的個性化科研或診斷需求來進行定制。Twist Bioscience 及其合作公司已經在中美兩國將這種技術推向市場,應用于科研和醫療領域各類豐富的場景當中。

    見微知著,一葉知秋——這既是 ctDNA 甲基化液體活檢法的技術內涵,同時也是該對領域目前的科學研究、臨床運用以及市場增長的生動寫照。

    傳統方法難以勝任ctDNA甲基化研究
    不同于已經得到廣泛深入研究的基因組 DNA 的表觀遺傳修飾,ctDNA 的 5mC 甲基化修飾研究仍然是一個未被充分探索的領域,對于科研者來說是一個尚待挖掘的金礦。既然如此,那我們是不是可以按圖索驥,直接將基因組 DNA 甲基化修飾研究的傳統方法照搬到 ctDNA 的5mC 甲基化修飾研究上來呢?答案是否定的:因為 ctDNA 含量低、缺乏染色質結構的保護,若直接將研究基因組 DNA 的 5mC 修飾的傳統方法應用于 ctDNA,則會遇到南橘北枳的困境:

    全基因組重亞硫酸鹽測序法(Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)一度是 DNA 5mC 測序的金標,可以將未經化學修飾的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U),并在后續的擴增和測序過程中被讀取為胸腺嘧啶(T),同時保持甲基化修飾的 5mC 和羥甲基化修飾的 5hmC 在測序中仍被讀取為 C。然而,WGBS 法需要極端的溫度和化學環境,容易造成 DNA 的斷裂降解;并且,WGBS 法對未經化學修飾的胞嘧啶(C)具有高比例的破壞力,致使 GC 富集區相比于 AT 富集區更容易丟失,在測序文庫中造成“GC 覆蓋度偏誤”。
    由于 ctDNA 含量低、穩定性差,若采用 WGBS 法對 ctDNA 進行 5mC 測序,將會難以避免地帶來很多負面影響:
    • 經化學處理后所得的 DNA 總量低,難以滿足測序文庫所需的量;
    • DNA 丟失嚴重,覆蓋度低,容易造成測序缺口(gap);
    • GC 檢測覆蓋程度不均一,未能反應真實情況。
    云序全新推出適用于ctDNA甲基化測序服務:EM-seq
    那么,有沒有一種實驗方法,既可以在溫和的環境中進行,又能夠無偏差地實現全基因組范圍內的 5mC 修飾測序呢?在此,云序生物為您帶來一種基于酶學方法的 DNA 甲基化測序技術 EM-seq(Enzymatic Methyl-seq),該方法結合使用多種酶,在保證 5mC 和 5hmC 在 Illumina 測序中仍被識別為 C 的前提條件下,將未發生修飾的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U),并在后續的擴增和測序過程中被識別為胸腺嘧啶(T)。EM-seq 有效彌補了 Bis-Seq 需要極端反應條件的缺陷,可以廣泛應用于包含 ctDNA 在內的微量脆弱 DNA 樣品。同時,EM-seq 得到的測序結果與 WGBS 得到的轉化序列相同,因此可以使用相同的數據分析流程。運用 EM-seq 技術,僅需低至 10 ng 的 DNA 樣品便可進行單堿基精度的全基因組 5mC 修飾測序。
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    EM-seq 的優勢相比于傳統的WGBS 擁有多種優勢:

    1、DNA 測序文庫質量高、所需 DNA 起始量小

    相比于WGBS,EM-seq 對 DNA 的損傷小,因此可以用更少 DNA 樣品、更少的 PCR 輪數擴增出高質量的測序文庫。云序生物提供的 EM-seq 服務,所需的 DNA 起始量可低至10ng。 

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    2、DNA 文庫的插入片段更長、更完整

    相比于WGBS,EM-seq 處理后的 DNA 片段更完整,長度更長,避免產生測序缺口。

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    3、出色的 GC 覆蓋均一性

    無論 GC 程度高低,EM-seq 的覆蓋度都有均勻且優良的表現;相比之下,WGBS 測序文庫高估了 AT 區,卻低估了 GC 區,造成“GC 覆蓋度偏誤”。

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    4、均一的雙核苷酸分布

    由于“GC 覆蓋度偏誤”的存在,在連續雙核苷酸的檢出效率方面,WGBS 對于不同的雙核苷酸存在較嚴重的偏誤,而 EM-seq 則能展示出均一的覆蓋情況。

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    5、更強的匹配率和更低的重復率

    相比于 WGBS,EM-seq 測序結果與參考基因組的匹配率更高,同時重復率更低。

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    6、用更少的測序檢出更多的 CpG 島

    同等測序覆蓋深度的情形下,EM-seq 所發現的 CpG 數目要遠多于 WGBS,在這其中有很大比例的 CpG 位點是僅僅只能能用 EM-seq 法才能檢測到的。
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    7、多次實驗之間的一致性更高

    EM-seq 文庫在不同起始量之間的相關性都很高,表明 EM-seq 檢出的數據具有很好的可重復性,且甲基化檢測靈敏度不會隨著起始量的減少而降低;相形之下,不同的 WGBS 文庫之間的相關性就不夠理想。

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    8、更精準地檢測轉錄起始位點的甲基化數據

    在低表達基因的轉錄起始位點附近,胞嘧啶一般會發生甲基化修飾,但由于 WGBS 法傾向于低估 GC 區域,因此難免遺漏一些轉錄起始位點附近的甲基化修飾;EM-seq 因為其出色的 GC 覆蓋均一性,可以更精準地檢測轉錄起始位點的甲基化數。
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    樣品要求

    1)樣品類型:腫瘤患者的血漿、血清或 cfDNA。
    血漿和血清相比較而言,推薦使用血漿,以減少淋巴細胞來源的 cfDNA 干擾。

    2)樣品量:血漿>5mL;血清>10mL;cfDNA>10 ng。

    3)血漿提?。?/span>
    使用 EDTA 抗凝管收集全血,切勿冷凍保存,只能在 2-8℃ 冰箱短暫存放,并盡快進行低溫離心獲取血漿。
    若不能進行低溫離心,則需要使用添加專有穩定劑的 STRECK 無創管來保存全血,可在常溫條件下離心。
    為了最大程度消除殘留的細胞,血漿需要進行二次離心:第一次在 4℃ 條件下以 1600g 離心 10 分鐘;第二次在 4℃ 條件下以 16000g 離心 10 分鐘。

    4)樣品保存:血漿、血清樣品液氮速凍后 -80℃ 冰箱保存。樣品保存期間避免反復凍融。

    5)樣品運輸:封口膜封好樣品,干冰運輸。

    云序生物服務優勢
    優勢一:一站式服務??蛻糁恍杼峁颖?,云序生物為您完成從ctDNA提取,文庫制備,上機測序到數據分析整套服務流程。
    優勢二:超微量ctDNA 起始量要求。云序生物可以進行低至 10 ng 的 ctDNA 測序。
    優勢三:測序數據真實可靠。云序生物避免了傳統 5mC 檢測方法的 GC 覆蓋度偏誤,還擁有更完整的 DNA 讀長,文庫質量更加可靠。
    優勢四:嚴格質控流程:云序生物質控流程嚴格,層層把關,為客戶提供高準確度的結果。
    優勢五:專業化生物信息分析:云序生物強大生物信息團隊,滿足客戶個性化數據分析要求。



      ctDNA 甲基化測序服務:EM-seq 新品促銷
    促銷內容:滿五送一
    促銷日期:2021.10.15-2021.12.31
    物種:人、大鼠、小鼠
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