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    m6A RNA甲基化測序
    m6A mRNA測序

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    技術簡介

    近年來,科學家們發現了一種可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發生甲基化修飾(N6-methyladenosine,m6A)。研究發現,m6A是真核生物mRNA上常見的一種轉錄后修飾,m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,以及在細胞分化、胚胎發育和壓力應答等過程中起重要作用。種種研究跡象表明m6A 存在于很多物種中,占到了 RNA甲基化修飾的80%。m6A除了分布在 mRNA 中,也出現在很多非編碼 RNA中 ,如:環狀RNA 、LncRNA等。Nature正刊發表文章,證實發生m6A RNA甲基化修飾可以調控mRNA穩定性。而隨后Cell Research也發表文章,證實環狀RNA也會被m6A甲基化修飾,并會促進環狀RNA編碼蛋白這一有趣的結論。

    云序生物(m6A)RNA甲基化測序流程

       云序生物(m6A)RNA甲基化測序流程

    云序生物RNA甲基化測序產品

    云序生物RNA甲基化測序產品

    云序優勢

    一站式服務:

    客戶只需提供細胞、組織或RNA,云序生物為您完成從MeRIP富集,文庫制備,上機測序到數據分析整套服務流程。

    優化的實驗流程

    MeRIP的富集效率是決定數據質量的關鍵,云序生物MeRIP實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程,具有極高的效率和特異性。

    嚴格的質控

    云序生物對MeRIP實驗的各個關鍵步驟進行嚴格的質控,全程監控實驗質量,確??蛻舻玫絻?質的數據。

    專業的生物信息學分析

    云序生物具有強大的生物信息學團隊,能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求。

    特異性高

    通過抗體特異性富集發生甲基化修飾的RNA片段,以較低的成本實現轉錄組范圍的RNA甲基化研究。

    樣本要求:

    樣品類型:

    細胞、組織或RNA,其他樣本類型請電詢。

    樣品量:

    a) 細胞:2×107 

    b) 組織:100 mg-1 g

    c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)

    樣品運輸及保存:

    樣品運輸:樣品置于1.5mL離心f管中,封口膜封好,干冰運輸。

    樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存; RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。

    數據分析(下列有※表示個性化分析)

    1. 識別甲基化富集峰

    通過高通量測序和生物信息分析,識別(p <10-5)甲基化富集的基因組區域。

                   識別甲基化富集峰

    注:每個樣品組做一個Input,以去除基因組背景,降低假陽性率

    2. RNA甲基富集峰注釋

    通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋,并根據峰中點相對于已知基因的位置,將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

                 RNA甲基富集峰注釋


    3. RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布

    根據注釋信息,繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。

    RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布


    4. RNA甲基化位點Motif分析

    RNA上甲基化的位點,可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些motif特異性進行甲基化修飾,從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后,獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些motif,從而揭示RNA甲基化修飾的機制。

    RNA甲基化位點Motif分析

    5. 差異RNA甲基化區域的識別與聚類

    云序生物使用 diffReps 軟件進行差異甲基化位點的識別。默認篩選標準為 FDR<=0.05,具體以報告為準。 識別樣本間的差異甲基化區,發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

    差異RNA甲基化區域的識別與聚類

    6. 差異甲基化區的GO與信號通路分析

    對差異甲基化基因進行功能分類,并發現明顯富集的功能條目。

    差異甲基化區的GO與信號通路分析


    7. Reads 的分布

    使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS, genebody, TES 等位點的分布情況,可以用來觀察 RNA 甲基化對TSS 等位點是否有偏好。


    Reads 的分布

    案例分析

    案例1:擬南芥花葉根組織m6A RNA甲基化譜

    原文:Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

    期刊:Genome Biology 影響因子:13.21

    西北農林科技大學聯合中科院和普渡大學,借助m6A RNA甲基化測序技術,對比擬南芥花,葉,根組織中(每種組織有兩個生物學重復)m6A RNA甲基化情況。結果發現檢測組織中m6A RNA甲基化修飾程度比人類高10%左右,占轉錄組的83%。


    比較擬南芥花,葉,根組織中m6A RNA甲基化情況

    圖1. 比較擬南芥花,葉,根組織中m6A RNA甲基化情況


    案例2:不同品系擬南芥m6A RNA甲基化譜 

    原文:Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

    期刊:Nature communications 影響因子:12.12

    芝加哥大學聯合北大,利用m6A RNA甲基化測序對比和品系擬南芥根組織中m6A RNA甲基化譜,發現的分布在兩個品種間高度保守。與人類m6A RNA甲基化位點分布情況相比,擬南芥甲基化位點在起始翻譯區特異性高表達。


      不同品系,同一基因上甲基化

    圖2. 不同品系,同一基因上甲基化 


    案例3:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過結合lncRNA促進膠質瘤細胞

    原文:m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

    期刊:Cancer Cell 影響因子:27.43 

    世界衛生組織將膠質瘤分為四級,其中惡性膠質瘤(GBM)屬于極危險的第四級,手術治 療和化療都難以避免其高復發率。近年來,m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域前沿研究之一,不斷有高影響因子文章問世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰,此時人們更關心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經膠質瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質瘤干性樣細胞表達上調,而ALKBH5高表達的膠質細胞瘤患者預后生存率更差。通過敲低ALKBH5,meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式,基因芯片檢測差異表達>2倍的基因,篩選到與細胞周期調控相關的FOXM1基因,其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化,增加FOXM1表達。隨后作者發現FOXM1反義長鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),與FOXM1 mRNA外顯子有457個核苷酸互補。結果證實ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,發揮促進惡性膠質瘤腫 瘤形成作用。 

                  ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,促進惡性膠質瘤腫瘤形成

                 圖3. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,促進惡性膠質瘤腫 瘤形成


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